基因编辑

Cas9-Cell line Knock-In service(Cas9-CKI)基因定点敲入细胞系是Cas9X技术团队针对实验室常用的各种细胞系,研究并确立针对不同的细胞的外源基因或者片段高效敲入(Knock-in, KI)的技术操作规程,主要目的就是:解决KI效率低下和KI片段长度限制的问题。

目前使用Cas9的进行基因KI研究方法,主要应用在目的基因后面加上标签,对目的蛋白进行定位;再有就是通过对小鼠细胞的目的基因进行修饰替换成为人的基因,用于动物的CDX模型等。KI实现的方案包括:使用合成的Oligo或者ssDNA(single-stranded DNA,ssDNA)作为“Donor”来实现长片段的敲入;也可以通过AAV病毒的方式(其病毒以ssDNA的方式存在于细胞核中)导入ssDNA作为“Donor”载体,也可以通过dsDNA片段或者环状质粒作为“Donor”来实现KI的目的。

但是不同的细胞模型KI的效率依然不能令人满意,且不同的细胞系之间的效率差异很大,很多细胞无法实现定点的KI。 Cas9X针对不同的片段的长度和不同的细胞特性使用不同的KI策略:小的片段使用Oligo进行KI,再长一点的使用ssDNA进行KI,如果长度超过1Kb的将使用重组的办法进行KI。针对细胞系的KI效率非常低的,需要先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和Donor的转染来提高KI效率。Cas9X努力优化实验条件满足不同细胞系和不同片段长度的KI服务需求。

Cas9X将为你的细胞探索最优化的KI实验方案。


|   技术原理图

基因定点敲入细胞系


|   技术流程图

基因定点敲入细胞系

我们还能为您提供:


  • 客户成果

      客户成果

      • 293细胞定点敲入基因片段

        细胞株:293T


        基因编辑类型:定点敲入

        检测方式:PCR、测序

  • 案例分析

      案例分析

    • |   基因敲入项目名称

      构建eGFP基因敲入的人胶质瘤细胞细胞
       
      实验设计

      种属:Human; 基因名称:PRNP
      gRNA位点:ATCTTCCTGATAGTGGGATGAGG
      Donor载体:5'arm-eGFP-3'arm
       
      策略图

      基因定点敲入细胞系

       
      细胞信息

      种属:Human; 细胞名称:人胶质瘤细胞U251
      培养基:DMEM,10%FBS
       
      细胞检测

      无菌检测:合格; 支原体检测:合格
      细胞克隆形成率检测:细胞增殖能力较好,克隆形成率较好。
      细胞基因型检测:针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序。测序结果与理论序列一致。
       
      细胞转导                                                           

      电转参数:1005V,35ms,2次; 电转体系:10 uL
       
      PCR筛选

      筛选克隆数量:160; 阳性数量:10
      电泳图示例:

      基因定点敲入细胞系

      基因定点敲入细胞系

       
      克隆状态

      基因定点敲入细胞系




  • 参考文献

      参考文献

    • 1.  Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

      2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
      3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
      4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research 27, 1099–1111.



友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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