ClonePlus™

  • 细胞基因敲入

海星生物提供ClonePlus™基因定点敲入细胞系构建:

1、提供纯合敲入的细胞克隆;

2、蛋白融合表达和定位设计方案更有效;

3、目标敲入片段的表达或者功能有保证;

4、敲入片段稳定不丢失;

特价!细胞基因敲入仅需3.88万

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Cas9-Cell line Knock-In service(Cas9-CKI)基因定点敲入细胞系是Cas9X技术团队针对实验室常用的各种细胞系,研究并确立针对不同的细胞的外源基因或者片段高效敲入(Knock-in, KI)的技术操作规程,主要目的就是:解决KI效率低下和KI片段长度限制的问题。

目前使用Cas9的进行基因KI研究方法,主要应用在目的基因后面加上标签,对目的蛋白进行定位;再有就是通过对小鼠细胞的目的基因进行修饰替换成为人的基因,用于动物的CDX模型等。KI实现的方案包括:使用合成的Oligo或者ssDNA(single-stranded DNA,ssDNA)作为“Donor”来实现长片段的敲入;也可以通过AAV病毒的方式(其病毒以ssDNA的方式存在于细胞核中)导入ssDNA作为“Donor”载体,也可以通过dsDNA片段或者环状质粒作为“Donor”来实现KI的目的。

但是不同的细胞模型KI的效率依然不能令人满意,且不同的细胞系之间的效率差异很大,很多细胞无法实现定点的KI。 Cas9X针对不同的片段的长度和不同的细胞特性使用不同的KI策略:小的片段使用Oligo进行KI,再长一点的使用ssDNA进行KI,如果长度超过1Kb的将使用重组的办法进行KI。针对细胞系的KI效率非常低的,需要先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和Donor的转染来提高KI效率。Cas9X努力优化实验条件满足不同细胞系和不同片段长度的KI服务需求。

Cas9X将为你的细胞探索优化的KI实验方案。


|   技术原理图

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|   技术流程图

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|   基因敲入项目名称

构建eGFP基因敲入的人胶质瘤细胞细胞
 
实验设计

种属:Human; 基因名称:PRNP
gRNA位点:ATCTTCCTGATAGTGGGATGAGG
Donor载体:5'arm-eGFP-3'arm
 

细胞信息

种属:Human; 细胞名称:人胶质瘤细胞U251
培养基:DMEM,10%FBS
 
细胞检测

无菌检测:合格; 支原体检测:合格
细胞克隆形成率检测:细胞增殖能力较好,克隆形成率较好。
细胞基因型检测:针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序。测序结果与理论序列一致。
 
细胞转导                                                           

电转参数:1005V,35ms,2次; 电转体系:10 uL
 
PCR筛选

筛选克隆数量:160; 阳性数量:10
电泳图示例:

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克隆状态

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1.  Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research 27, 1099–1111.




友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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