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VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术,以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域,在转座酶的催化下,将目的RNA干扰片段从载体上切割下来形成一个小环结构,并在基因组里面的固定序列位置进行插入,从而实现稳转,并开始表达RNA干扰分子,实现对细胞固定基因的mRNA靶向Knockdown。


基因干扰-海星生物


|   技术优势

1. 速度快,只需要构建载体;

2. 可插入多组不同的干扰序列,可以同时靶向多个mRNA,可以进行复杂的基因功能研究;

3. 目的插入效率高,由于通过酶促反应,所以整个反应的过程效率远远高于DNA随机插入效率;

4. 目的基因表达稳定,由于细胞插入的拷贝数相对于病毒来说比较稳定,在稳转株的构建过程中,细胞的表达更加稳定,干扰效果稳定;

5. 实验时间只需要慢病毒系统时间一半,实验更加安全;

6. 可以实现:稳转之后对目的克隆进行检测后可以再将shRNA在原克隆移除,轻松实现加减法的对照。基因干扰-海星生物


|   技术流程图

基因干扰-海星生物


|   VIRUS-Free™ 细胞RNA干扰技术

我们将通过载体构建的办法来获得质粒,并进行细胞转导,通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

Step1. 目的干扰序列合成

Step2. 目的载体的构建获得干扰的VIRUS-Free™ 载体

Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆

基因干扰-海星生物

 我们能为您提供:


  • 客户成果

      客户成果

  • 案例分析

      案例分析

    • |   案例分析:VIRUS-Free™ 技术在构建稳转株中的应用


      1. 实验目的

      利用VIRUS-Free™ 技术构建表达荧光的稳转株,并验证所获得的细胞株的稳定性。


      2. 实验用品

      细胞:人结直肠癌细胞HCT116(Cas9X自有细胞库,经培养验证其生长状态、增殖速度、克隆形成率、电转阳性率等均良好)

      质粒:VIRUS-Free™ 构建的EGFP-Puro载体(结构如下图)

      基因干扰-海星生物


      试剂:细胞培养相关试剂、电转液、多聚甲醛固定液

      仪器:电转仪、NovoCyte Advanteon流式细胞仪(NovoExpress软件)


      3. 实验步骤

      基因干扰-海星生物

      收集Pn/Pn+3/Pn+4……Pn+n,流式上机,对比各组GFP阳性率及强度

       

      4. 实验结果

      4.1  电转

      按照适当比例,向备好的细胞样品中加入VIRUS-Free™ 质粒,充分混匀后对细胞进行电转。

      24h后观察荧光表达效果,GFP阳性率约50%。

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      24h后镜下观察Pn细胞GFP表达

       

      4.2  药筛

      继续培养上述Pn细胞至48h,加入含一定浓度抗性药物puro的完全培养基,同时用该培养液培养野生型细胞作为对照组。

      3天后,对照组细胞已全部死亡,实验组细胞荧光表达良好,流式GFP阳性率95.72%。

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      药筛3天后镜下观察Pn细胞荧光表达


       基因干扰-海星生物

      流式检测GFP阳性数据,(a)野生型散点图;(b)野生型直方图;(c)转染细胞直方图,GFP阳性率为95.72%


      4.3  传代

      将上述Pn细胞预留一部分进行若干次传代,传代过程中使用不含药物的培养基。

      从Pn+3开始,每次传代均取样固定待测定流式,直到Pn+9结束传代,GFP均稳定表达。

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      Pn+1细胞荧光表达

       

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      Pn+9细胞荧光表达


      基因干扰-海星生物

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      5. 实验结论

      A. 利用VIRUS-Free™ 系统能够构建表达目的基因的稳转株;

      B. 与常规质粒相比,VIRUS-Free™ 系统转导的细胞,显著表达时间为3-5天,时间因细胞而异;

      C. 利用VIRUS-Free™ 系统获取的稳转株,经过药筛可稳定长时间高效地表达目的蛋白。



  • 参考文献

      参考文献

    • Li R, Zhuang Y, Han M, et al. piggyBac as a high-capacity transgenesis and gene-therapy vector in human cells and mice. Dis Model Mech 2013;6:828-33.

      Hou X, Du Y, Deng Y, et al. (2015). Sleeping Beauty transposon system for genetic etiological research and gene therapy of cancers. Cancer Biol Ther 16:8–16.


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友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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