|  可变剪接与临床致病

pre-mRNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤，其剪接异常会引起基因表达量异常、蛋白质功能改变，是疾病发生的常见原因。 

随着新一代测序技术的发展，大量的潜在致病变异被发现，根据文献报道，大约1/3的致病变异会导致pre-mRNA剪接异常，常见的为：整个外显子缺失、部分外显子缺失、整个内含子保留（即内含子变为外显子）、部分内含子保留（即剪接发生在内含子上其他符合splice site特征的位点）、多个外显子缺失等。而这些异常剪接的结果是蛋白质缺失一段氨基酸或者更为常见的翻译提前终止。

|  目前大部分致病变异的临床意义未知

临床上DNA测序检测出碱基突变，怀疑变异位点影响pre-mRNA的剪切，从而影响基因功能，但是却没有样本来进行验证怎么办？Minigene技术可以解决这个问题。 

Minigene splicing assay，是一项针对突变位点是否影响mRNA剪接的细胞水平验证实验。该技术通过将带有变异基因的外显子和内含子片段的质粒转染细胞后，利用RT-PCR及Sanger测序检测异常mRNA产物，进而分析基因变异对pre-mRNA可变剪接的影响（如内含子滞留和外显子切除）。

|  Minigene splicing assay的技术服务和流程

              ·  项目周期：6-9周

              ·  结果交付：

            （1）构建的载体；

            （2）实验报告：包括实验步骤，引物序列，测序峰图，结果图片和分析结果

| Minigene splicing assay应用案例介绍

Minigene技术验证鱼鳞病综合征SPINK5基因突变导致剪接异常 

SPINK5基因，c.891C>T变异，造成剪接异常，导致11号外显子（SPINK5 Ex11）被切除，生成异常蛋白，引起危及生命的鱼鳞病综合征（Netherton syndrome）。

| 知识延伸 

| 剪切识别元件

突变之所以影响pre-mRNA剪切，是因为基因在内含子和外显子中均包含各种顺式作用元件，这是pre-mRNA正确、有效的拼接所必需的。顺式元件主要包括：5'和 3’剪接位点、内含子剪接增强子（ISE）、内含子剪接沉默子（ISS）、外显子剪接增强子 (ESE) 、 外显子剪接沉默子 (ESS)。这些元件的突变就可能造成异常剪接，而最常见的是在外显子-内含子接头处位点的突变，如5'和3’ splice site的突变（内含子两端为AG-exon-GT保守序列）。

（剪接识别元件）

| Minigene reporter——基于Minigene技术的表型筛选方法

基于Minigene reporter技术的表型筛选方法，为攻克异常剪接引起的疾病的治疗提供了重要的方法，通过表型筛选得到理想的化合物后，再利用相关技术确认作用靶点，此类策略是开发First in class药物非常有效的方法。

Novartis就曾采用过这个技术来筛选治疗SMA（脊髓型肌萎缩）的小分子化合物。SMA（脊髓型肌萎缩）是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病，常见于婴幼儿，主要表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等，大部分患儿在不到两周岁时死亡。其中一个发病原因是：SMN2基因中的一个碱基异位突变，导致其转录的mRNA前体在剪接时容易丢失7号外显子，因此只能产生10%-20%的正常SMN蛋白，造成SMA。这是典型的mRNA前体剪接异常造成的关键蛋白表达障碍。

Novartis通过Minigene reporter技术，对大约1.4ⅹ106个化合物进行筛选，得到了可以稳定SMN2 pre-mRNA和U1 snRNP（剪接体的关键组成部分）结构的小分子化合物，进而提高了SMN2 mRNA正确剪接的比例。