一、Luciferase标记肿瘤细胞株的应用原理

活体成像技术可以以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程，适合肿瘤体内生长的定量分析。活体成像能节省动物成本，能以无创的方式对小动物的生物学行为成像跟踪，已被广泛应用于肿瘤研究。目前的活体生物体内成像技术有超声、CT、MRI、PET等，此外还有生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP、Cyt及dyes等）进行标记。

荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素酶在氧气、ATP存在的条件下，给予外源（腹腔或静脉注射）底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内发生氧化反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。此发光现象只有在活细胞内才会产生，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。在动物体内，光在传播时会被散射和吸收，可见光主要是被血红蛋白吸收，主要吸收的是可见光蓝绿波段；但在大于600 nm的红光波段，血红蛋白的吸收作用比较小，也就是说，大量的光虽然有部分散射但可以透过组织和皮肤而被高灵敏CCD检测到。通过选用适当的CCD镜头、成像暗箱，可由仪器量化检测到光强度，同时反映出细胞的数量。该项技术操作方便，测量迅速，图像清晰，信噪比低，价格便宜，可精确定量，易于被大多数研究员接受，在动物体内研究方面得到广泛应用。

二、Luciferase标记细胞株应用技术常见问题

1. 表达荧光素酶会影响细胞功能吗？

荧光素不会影响动物的正常生理功能。

2. 荧光素酶稳定吗？

哺乳动物生物发光，一般是将荧光素酶基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时,荧光素酶也会得到持续稳定的表达。

3. 在体外细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？

Luc标记的细胞株能稳定表达荧光素酶。体外培养过程中，只要培养时间不是很长，代次不是很高，不加压筛选也可以。到目前为止，还没有报道基因丢失的情况，但若细胞传代次数过多，还是建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度。

4. 体内成像为什么没有看到荧光，或者荧光微弱？

① 需要专业的镜头和暗箱隔绝外界的光线。仪器对发光细胞检测的灵敏度与细胞发光的强度有关。两个主要原因使可见光成像技术能够看到体内发出的微弱的可见光。一是高灵敏度的制冷CCD镜头，可达到零下-90°C，使体内发出的非常少的光子也能够检测到。二是绝对密封的暗箱装置，可以屏蔽包括宇宙射线在内的所有光线。

② 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，10分钟后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30分钟后开始衰减，约3小时后荧光素排出，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35分钟之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150 mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。

③ 利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。标记细胞活跃发光的情况下，仪器可以检测到最少100个皮下接种的发光细胞。若细胞在体内位置深(如原位种植)，比如内脏，最少能检测到的细胞数目需要多一些。

④ 不同品牌的荧光素底物的代谢过程不太一样，使用前最好做一些体外试验，做一个标准曲线。

此外还有成瘤时间、小鼠品系等影响因素，成瘤需要时间，一般裸鼠和免疫缺陷鼠是比较常用的，易于成瘤。

5. 体外检测荧光值为什么很低？

① 检测时间：荧光素酶的体外半衰期一般约30分钟，加完底物后可立即检测，尽量在30分钟内完成；

② 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号；

③ 酶标仪一般不需要选择波长，选择滤光片就可以；

④ 荧光素底物不同，底物需避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20 ℃保存；需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差。

6. 小鼠成像为什么要进行脱毛？

小鼠毛发会阻挡、吸收和散射光线，且毛发会产生强烈的自发荧光。如果不脱毛，将会在成像时产生很强的信号背景。

7. 能检测到动物组织内部的发光吗？

发光源在动物体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍。荧光素酶标记适合体外检测，或者皮下检测，不适合大部分深层脏器的标记，但对于小鼠来说，若有发光足够强的标记细胞，在老鼠体内任何一个地方都能看到细胞瘤，荧光穿透可达3-4厘米,而小鼠本身厚度为7-8厘米。

8. 除了观察肿瘤细胞的走向，荧光素酶技术能用于其他研究吗？

该技术能快速测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并对肿瘤细胞穿的变化进行实时评估，还可以用标记干细胞示踪，白血病研究，标记细菌，此外荧光素酶技术还可以用于细胞凋亡基因和表达和蛋白质相互作用，包括组织特性性基因表达、蛋白质相互作用的研究。

海星生物自研200多种的荧光素酶（Luciferase, Luc）标记细胞库，涵盖常用的细胞类型，每株细胞都经STR或物种检测、荧光素酶功能验证，海星生物可以提供全套的验证数据报告，保证无支原体污染，并且可以提供来源报告。海星生物提供的Luciferase稳转细胞株采用慢病毒法构建，除稳定高效地表达荧光素酶外，还具有发光强度高、体内成瘤与成像效果好等优点，可满足活体动物成像和体外分析等多方面的应用需求。

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