原代人真皮成纤维细胞的分离

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成纤维细胞（存在于真皮层）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核大而明显。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺聚糖和糖蛋白等基质成分。

人真皮成纤维细胞的分离培养

(1) 将手术废弃的皮肤组织浸泡 75% 酒精，消毒 2min；

(2) 将皮肤组织置含 P/S 的 PBS 中清洗至少 3 遍；

(3) 然后用眼科剪除去脂肪及结缔组织等；

(4) 将皮肤剪成 0.5*0.5 cm 小块，放入 dish 中，加 0.1% 的 dispase 溶液，封口膜封口，4℃ 冰箱过夜消化；

(5) 第二天，用镊子将表皮与真皮分开（薄的那层是表皮，厚的那层是真皮）；

(6) 将真皮剪碎，移至离心管，用 0.1% 胶原 Ⅰ 型酶+0.1% 胶原Ⅱ型酶+0.1% 胶原Ⅳ型酶+ 37℃ 水浴锅中消化至少 2 h（视消化程度而定）；

(7) 用 100 μm 网筛过滤，

(8) 取滤液，300 g，离心5 min，

(9) 用人真皮成纤维细胞完全培养基重悬沉淀，

(10) 铺瓶，37℃培养箱培养

(11) 隔天换液。

刚分离的真皮成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；

6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速；

5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。

细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。

真皮成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持组织的正常形态，合成和释放细胞外基质以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。

真皮成纤维细胞（又称皮肤成纤维细胞）属于由中胚层分化而来的间质细胞。细胞来源于人正常的皮肤组织，真皮成纤维细胞是一种贴壁培养方式的细胞，由于这些细胞非常容易培养，它们已经被广泛用于细胞和分子生物学研究中。

一般而言，成纤维细胞能够分泌I型和 III 型胶原等细胞外基质，并且研究表明不同器官中的成纤维细胞有显著的不同。

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