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THP-1细胞基因编辑

在血液粒细胞的研究中,THP-1是一个非常经典的细胞模型。如何在THP-1细胞株进行基因敲除/基因敲入/基因突变也是各个课题组的一个关心的问题!如何解决THP-1细胞的基因敲除,也是我们海星生物的一个重要的研发方向,经过了一年多的研发,我们终于在根本上解决了这个THP-1细胞株的基因编辑的困难,可以为客户提供编辑效率高、结果稳定、周期快速的细胞基因敲除的解决方案。

具体的THP-1细胞基因敲除/基因敲入/基因突变的技术流程如下:

1、THP-1细胞的培养条件的优化和克隆形成的优化;

在原来ATCC推荐的培养基的基础上,我们优化获得的培养基的条件如下 :RPMI-1640 Medium,2-mercaptoethanol 0.05 mM,fetal bovine serum 10%(专门优化筛选批次),抗氧化添加物。

由于加入了抗氧化的成分,大大提升了THP-1细胞的增殖的速度和克隆形成效率,同时由于对渗透压进行专门的优化,也使得THP-1的细胞的形态更加完美。(下图是接种时与48小时后的对比)

细胞接种的密度

细胞48小时后的图片

2、THP-1细胞优化的电转效率和存活率;

由于THP-1细胞是悬浮培养,所以对很多病毒的转染效率不高,所以电转是理想的选择。依据这个细胞的特性,海星生物优化了其中的电转的缓冲液,加入了吸附剂,可以大大促进DNA吸附到细胞的表面,同时还加大的缓冲液的电阻,从而可以提供电转的电压,从而大幅度的提升了电转的效率,是传统缓冲系统的3-5倍的效率,达到80%。同时由于提升了细胞的存活率到90%,所以细胞的基因编辑的效率也得到了大幅提升。

GFP荧光电转染后

【GFP表达载体电转后72小时对比图片】

3、THP-1细胞的快速克隆化条件优化;

由于使用了ClonePlusTM技术,THP-1的细胞克隆形成能够达到95%以上,而且克隆形成的时间也缩短到1-2周的时间,大大压缩了整个克隆检测的时间周期。(而传统的克隆过程需要1个月)

悬浮细胞的病毒感染效率极低,多有死细胞且容易黏连,不利于后续筛选。因此采用Cas9X | 海星生物VIRUS-Free技术,与病毒法相比,效率更高,周期更短,而且可以规避病毒重新复制的风险。悬浮细胞与贴壁细胞相比,其药物抗性筛选难度大,单克隆化效率低,再加上基因定点突变效率远低于基因敲除效率,两种因素叠加导致拿到突变纯合子的概率极低。Cas9X | 海星生物的ClonePlus技术, 采用专有的胶体表面处理,THP-1细胞株的克隆率超过95%,可以轻松进行克隆分离和克隆PCR鉴定,大幅提升悬浮细胞的鉴定阳性率。VIRUS-Free技术:是一种利用转座子进行细胞稳转株的构建和筛选的技术,以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域,能将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构,并在基因组里面的固定序列位置进行插入,从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用,并充分体现出其:低成本、高效率、基因表达稳定的特点ClonePlus技术:是Cas9X技术平台研发的专有高效细胞敲除技术,主要通过高通量电转系统和高通量的克隆分选技术结合,获得基因编辑的单细胞,其克隆形成率可以达98%,就算是克隆形成率低的细胞株也能获得敲除单克隆,针对悬浮细胞也有更高的单克隆形成率。4、THP-1细胞株快速特性。

市面上多数THP-1细胞质量均比较差,转染效率很低。筛选到优质的THP-1细胞是项目成功的关键因素之一(海星生物自有的THP-1细胞已成功完成23个基因编辑项目,其中包含基因敲除和定点突变项目)。

海星生物基因敲除细胞株的成功案例

5、与市场上其他公司的THP-1技术服务的对比:


友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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