MixClone™源自海星生物的技术集成
MixClone™技术可用于快速构建原代细胞、干细胞等困难细胞的基因敲除细胞株。MixClone™技术可以替代RNA干扰技术，成为新一代的基因功能分析工具。可用于大规模的基因功能筛选、基因功能缺失性研究、药物靶点发现、药物靶点验证、基因敲除细胞的体外成瘤性研究以及基因通路相关的细胞信号转导、代谢、增殖\迁移能力等研究。MixClone™极大地简化了基因编辑流程，周期短至四周，价格只有RNA干扰的一半；独有的技术方法和严格的工艺流程控制，基因编辑效率可以高达80-95%，可直接用于下游基因功能分析。
MixClone™技术在不同细胞系上的敲除效率
(AAVS1位点是位于人类基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列，被认为是外源基因导入的safe harbor，不影响其它基因的表达。)
与RNA干扰相比，MixClone™技术具有更显著的敲除效果。RNA干扰主要是利用小RNA与mRNA结合，导致靶标mRNA的降解，因而能暂时性地敲低(knockdown)基因的表达水平，敲低水平<70%。在过去十几年中对基因功能的研究发挥着重要的作用，并经常用于大规模功能基因筛选。然而，由于RNA干扰靶向的是每个mRNA的转录产物，因此并不能导致目的蛋白的完全丢失。也正是因为RNA干扰的靶向mRNA的特点，其基因敲低实验经常产生不同的结果，同一小RNA在不同细胞或不同实验重复下，其结果差异比较大，实验重复性不好。RNA干扰还有一个问题就是更容易出现脱靶现象。而MixClone™技术是基于CRISPR/Cas9系统产生的的基因敲除，因而其功能缺失检测数据更为可靠，是新一代的基因功能研究工具。
RNA干扰和CRISPR技术的on-target(横坐标)和off-target(纵坐标)相对强度的比较
共分析了1723条sgRNA（右图），其on-target的平均相对强度为0.211，off-target的平均相对强度为0.062，97.4%的sgRNA其on-target的效率要高于off-target的效率（对角线以下的点）。同时分析了924条shRNA（左图）（其靶基因与sgRNA一致），其on-target的平均相对强度为0.197，与sgRNA的效率接近；然而其off-target的平均相对强度为0.230，远高于sgRNA，且只有41.8%的shRNA其on-target的效率高于off-target的效率（对角线以下的点）。这个数据表明与RNA干扰相比，CRISPR技术具有更加高效的基因靶向性，同时脱靶风险更低。
MixClone™的技术流程
MixClone™的交付内容
1. 两管基因敲除细胞，承诺80-95%的基因编辑效率
（一管可以直接用于下游基因功能分析；另一管可以用于单克隆筛选，得到100%敲除效率的纯合单克隆，用于长期研究。）
2. 两管野生型对照细胞
3. 可根据实验需要个性化定制多管细胞
MixClone™技术的实现基础
Smart-optimization™平台
不同细胞株，大小不一样，形态不一样，表面积不一样，其适合的电转参数也不一样。没有两个细胞是一样的，也没有一种protocol适用于所有的细胞。虽然高的电场强度更有利于DNA进入细胞但却会导致细胞死亡，使整体转染效率降低。脉冲持续时间、相同时间内连续的脉冲以及脉冲的波形也会对DNA转染效率和细胞存活率产生影响。我们需要在众多组合中找到高转染效率和高细胞存活率并存的条件。为此我们建立了针对每一种细胞的高通量、自动化的快速优化平台Smart-optimization™。只需要输入细胞系的名称，Smart-optimization™会从各大公开数据库中获取细胞的相关信息，并给出96个电转方案，按综合得分从高到低排列。同时系统会根据收集回来的历史数据判断安排多少组测试性价比高，多时可以一次性测试96个电转条件。细胞电转3天后，进行荧光信号检测，同步收集细胞存活率数据和荧光数据，匹配Smart-optimization™的自动分析系统，可瞬间获取适合的电转参数组合。整个优化过程只需要3天。经过优化后的细胞转染效率平均提高25%。
不同的电转参数，电转后细胞的存活率和阳性率差异很大
1号组（存活率：73.6%；荧光率90%）
2号组（存活率：32.3%；荧光率100%）
5号组（存活率：15%；荧光率100%）
分子运输载体：
任何的转染技术，外源DNA分子在进入细胞之前，必须实现2个关键过程，一是要使DNA尽可能接触到细胞膜，二是要诱导细胞膜发生可逆变化，使细胞膜瞬间开孔，使外源DNA分子通过细胞膜上的孔洞进入到细胞质中。基于这个技术原理，我们使用特殊分子材料粘附DNA分子，带有正电荷的DNA分子颗粒可以大量吸附到细胞膜表面。在电击作用下细胞膜瞬间开孔，DNA分子由此进入到细胞质中。并且可以有效防止DNA被细胞内的核酸酶快速降解，延长了DNA在细胞内的半衰期，并解决了DNA进入细胞核的障碍。从而大大提高了细胞的转染效率和基因编辑效率。
电转染技术运输DNA的过程：1.DNA粘附到细胞膜上；2.电击穿孔；3. 包裹有DNA的囊泡形成；4. DNA被运输到细胞内
促进Cas9蛋白解离的Enhancer
在sgRNA的引导下，Cas9蛋白对靶序列进行切割并产生DSB（双链断裂）。然而Cas9蛋白并不会立即从靶位点DSB上解离下来，反而会非常牢固地结合在靶位点上，其解离过程非常缓慢，会持续6-15小时。由于Cas9蛋白在靶位点DSB上的稳定结合，导致DSB躲过了基因组修复系统的监控，不能对双链断裂进行及时的修复（编辑）。这是影响基因编辑效率的一个重要因素。
a. Cas9蛋白在靶位点处产生双链断裂（DSB），并稳定结合在靶位点DSB上
b. 体外条件下，Cas9蛋白和靶位点DNA结合的动力学分析：虚线左侧是分子间结合的速度；虚线右侧是分子复合物解离的速度
为此，我们在电转体系中引入一种分子——Enhancer，可以促进非互补链的3’端序列从Cas9蛋白中游离出来，破坏Cas9-DSB结合的稳定性，并招募SSB蛋白（单链结合蛋白）等基因组修复因子，促进对双链断裂位点的修复，因而可以进一步提高基因编辑效率。
智能算法准确计算基因编辑效率
经过Cas9编辑的混合细胞中存在多种基因型，其结果分析被认为是整个工作流程当中比较繁琐的环节。NGS测序是基因组编辑分析的金标准，但是成本高、耗时长。另一种更为常规的做法是，将混合细胞的PCR产物进行亚克隆，挑选几十到上百个单克隆进行测序分析，从中可以统计到混合细胞中所出现的基因型情况及其发生频率。但这项目工作耗时极长、工作量巨大。因此，找到一种快速廉价的结果分析方法是实现MixClone™技术的最后一公里路。
由于混合细胞中存在多种基因型，将其PCR产物直接进行测序的话，切割位点下游的序列将会出现多重套峰，每个套峰间两两组合将可以产生数十亿、数百亿种排列组合，难以确定实际的编辑后序列。
上图：混合细胞中存在多种基因型，PCR产物测序出现套峰
下图：野生型细胞，PCR产物测序单一峰型
为了解决这个问题，我们借助了一套智能化算法来准确计算出混合细胞中的实际基因型。其精确度可以媲美NGS测序，能够对Sanger测序数据进行快速的、具有可重复性的分析，且比NGS成本低100倍。该算法的主要逻辑是：
1. 将sgRNA和野生型序列进行比对，推断预期的切割位点，并根据Cas9基因编辑产生Indel的特点，围绕着预期切割位点，采用标准的非负线性建模，构建一个庞大的模拟编辑序列库。
2. 将预期切割位点上游的野生型序列和实验样品测序结果进行比对，找到二者间不匹配的地方，即找到实际的切割位点，并确定套峰分析区域（实际切割位点上下游的一部分序列）。
3. 将实验样品的套峰分析区域与模拟编辑序列库进行比对，通过非负最小二乘回归，从模拟编辑序列库中找到与实验样品测序图谱吻合的线性组合（即有可能存在于样品中的序列组合）。计算R2，评估二者的拟合度。
4. 由于测序峰图上碱基的峰型高度与该碱基的丰度呈线性相关。因此通过统计每一个位置碱基的峰型高度，可以确定突变位点处碱基在序列总体中的相对丰度。通过标准误差方差-协方差矩阵的二次t检验计算出P值，判定相对丰度评估的显著性。
5. 输出：实验样品的编辑效率；被编辑后的序列以及其在样品中的占比；以及本次分析的可信度。
基于测序峰图的智能分析算法
1. 基因编辑效率: Indel%: 94
2. 拟合度R2: 0.95 0.95（拟合度良好）
3. 测序样品中的编辑序列及其所占的比例
| MixClone™基因敲除细胞的应用案例
CAR-T细胞的DGK基因敲除及其抗肿瘤活性分析
实验流程：
Day 1: CRISPR/Cas9转染139 CAR-T细胞，敲除DGK基因
Day 5: 深度测序分析脱靶效应
Day 9: 抗肿瘤活性分析
Day 1: CRISPR/Cas9转染139 CAR-T细胞，敲除DGK基因
使用CRISPR/Cas9技术在139 CAR-T细胞上分别对DGKα基因、DGKζ基因、DGKα和DGKζ双基因(DGKαζ)进行敲除。基因编辑效率（Indel）可以达到80%-90%；移码突变的效率分别为66.7%（αKO 139 CAR-T）和59.6%（ζKO 139 CAR-T）。基因水平的敲除效果分析与蛋白水平检测（Western blot）的结果一致。
左：基因编辑效率；右：移码突变效率（IF: in-frame; OF: out-of-frame）
Western Blot分析
Day 5:深度测序分析脱靶效应
对基因敲除细胞进行深度测序分析（in silico analysis和Digenome-seq），发现无明显的脱靶效应
Day 9: 抗肿瘤活性分析
139 CAR-T细胞的杀伤活性分析
用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与139 CAR-T细胞（AAVS1 KO、DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO）共培养，18小时后，收集细胞，计算U87vIII肿瘤细胞的死亡百分率，进行细胞杀伤活性分析。
（AAVS1 KO 139 CAR-T细胞作为阴性对照）
实验证明DGK基因敲除的139 CAR-T细胞（DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO）比对照CAR-T细胞（AAVS1 KO）有更显著的细胞杀伤作用。
细胞因子浓度水平测定
用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与139 CAR-T细胞（AAVS1 KO、DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO）共培养，18小时后，收集共培养物的上清，对上清中的细胞因子（IL2、IFNγ）含量进行测定。
细胞因子分泌量（IFNγ和IL2）的分析
DGKαζ KO双基因敲除的139 CAR-T细胞比DGKα KO或DGKζ KO单基因敲除的139 CAR-T细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和IL2，DGKαζ双基因敲除协同促进139 CAR-T细胞的效应功能。
139 CAR-T细胞增殖能力分析
将经CellTrace标记的139 CAR-T细胞（AAVS1 KO、DGKαζ KO）分别与U87vIII肿瘤细胞共培养4天后，收集139 CAR-T细胞，并和新的U87vIII肿瘤细胞共培养1天。通过流式细胞术分析139 CAR-T细胞的增殖情况。
结果表明，在肿瘤细胞的重复刺激下，AAVS1 KO 139 CAR-T细胞进入衰退状态，几乎不增殖；相反，DGKαζ KO 139 CAR-T细胞则越过衰退障碍，成功增殖。
体内肿瘤杀伤活性分析
将1×106的U87vIII肿瘤细胞皮下注射到8周大的NSG小鼠体内，皮下注射后第28天和第32天，分别注射5×106 的139 CAR-T细胞（T细胞、AAVS1 KO 139 CAR-T、DGKαζ KO 139 CAR-T）。在第32天到第35天期间，每天腹腔注射替莫唑胺。每两周测定肿瘤大小。
结果表明，在肿瘤异种移植小鼠模型中， T细胞和AAVS1 KO 139 CAR-T细胞均未能控制肿瘤消退。相比之下，在接种后第56天，DGKαζ KO 139 CAR-T细胞可以引起明显的肿瘤消退。
本案例通过CRISPR/Cas9技术敲除DGK基因来提高CAR-T细胞的抗实体瘤能力，为人类癌症免疫治疗提供一种新思路。
本案例也表明MixClone™基因敲除细胞可以用于基因功能缺失性研究、基因通路相关的细胞信号研究、基因敲除细胞的体外成瘤性研究以及细胞增殖能力等研究。具有效率高、周期短、成本低等优势，是新一代的基因功能分析工具。
| 参考文献
Smith I, Greenside PG, Natoli T, Lahr DL, Wadden D, Tirosh I, et al. (2017) Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol 15(11): e2003213.
E. Imai, Y. Isaka. Gene electrotransfer: Potential for gene therapy of renal diseases. Kidney Int., 61 (2002), pp. 37-41
C. D. Richardson, G. J. Ray, M. A. DeWitt, G. L. Curie, J. E. Corn, Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339–344 (2016).
Jung IY, Kim YY, Yu HS, Lee M, Kim S, Lee J. CRISPR/Cas9-mediated knockout of DGK improves antitumor activities of human T cells. Cancer Res. 2018;78(16):4692–703.
