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MixClone™高通量高效率的Cell Pool构建技术,可以在3-5周内轻松构建基因编辑的Cell pool
  • 基因敲除 MixClone™
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MixClone™源自海星生物的技术集成


MixClone™技术可用于快速构建原代细胞干细胞等困难细胞的基因敲除细胞株。MixClone™技术可以替代RNA干扰技术,成为新一代的基因功能分析工具。可用于大规模的基因功能筛选基因功能缺失性研究、药物靶点发现、药物靶点验证基因敲除细胞体外成瘤性研究以及基因通路相关的细胞信号转导、代谢、增殖\迁移能力等研究。MixClone™极大地简化了基因编辑流程,周期短至四周,价格只有RNA干扰的一半;独有的技术方法和严格的工艺流程控制,基因编辑效率可以高达80-95%,可直接用于下游基因功能分析。

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MixClone™技术在不同细胞系上的敲除效率

(AAVS1位点是位于人类基因PPP1R12C第一个内含子上的一段特定序列,被认为是外源基因导入的safe harbor,不影响其它基因的表达。)

与RNA干扰相比,MixClone™技术具有更显著的敲除效果。RNA干扰主要是利用小RNA与mRNA结合,导致靶标mRNA的降解,因而能暂时性地敲低(knockdown)基因的表达水平,敲低水平<70%。在过去十几年中对基因功能的研究发挥着重要的作用,并经常用于大规模功能基因筛选。然而,由于RNA干扰靶向的是每个mRNA的转录产物,因此并不能导致目的蛋白的完全丢失。也正是因为RNA干扰的靶向mRNA的特点,其基因敲低实验经常产生不同的结果,同一小RNA在不同细胞或不同实验重复下,其结果差异比较大,实验重复性不好。RNA干扰还有一个问题就是更容易出现脱靶现象。而MixClone™技术是基于CRISPR/Cas9系统产生的的基因敲除,因而其功能缺失检测数据更为可靠,是新一代的基因功能研究工具。

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RNA干扰和CRISPR技术的on-target(横坐标)和off-target(纵坐标)相对强度的比较

共分析了1723条sgRNA(右图),其on-target的平均相对强度为0.211,off-target的平均相对强度为0.062,97.4%的sgRNA其on-target的效率要高于off-target的效率(对角线以下的点)。同时分析了924条shRNA(左图)(其靶基因与sgRNA一致),其on-target的平均相对强度为0.197,与sgRNA的效率接近;然而其off-target的平均相对强度为0.230,远高于sgRNA,且只有41.8%的shRNA其on-target的效率高于off-target的效率(对角线以下的点)。这个数据表明与RNA干扰相比,CRISPR技术具有更加高效的基因靶向性,同时脱靶风险更低。


MixClone™的技术流程

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MixClone™的交付内容

1. 两管基因敲除细胞,承诺80-95%的基因编辑效率

(一管可以直接用于下游基因功能分析;另一管可以用于单克隆筛选,得到100%敲除效率的纯合单克隆,用于长期研究。)

2. 两管野生型对照细胞

3. 可根据实验需要个性化定制多管细胞


MixClone™技术的实现基础

Smart-optimization™平台

不同细胞株,大小不一样,形态不一样,表面积不一样,其适合的电转参数也不一样。没有两个细胞是一样的,也没有一种protocol适用于所有的细胞。虽然高的电场强度更有利于DNA进入细胞但却会导致细胞死亡,使整体转染效率降低。脉冲持续时间、相同时间内连续的脉冲以及脉冲的波形也会对DNA转染效率和细胞存活率产生影响。我们需要在众多组合中找到高转染效率和高细胞存活率并存的条件。为此我们建立了针对每一种细胞的高通量、自动化的快速优化平台Smart-optimization™。只需要输入细胞系的名称,Smart-optimization™会从各大公开数据库中获取细胞的相关信息,并给出96个电转方案,按综合得分从高到低排列。同时系统会根据收集回来的历史数据判断安排多少组测试性价比高,多时可以一次性测试96个电转条件。细胞电转3天后,进行荧光信号检测,同步收集细胞存活率数据和荧光数据,匹配Smart-optimization™的自动分析系统,可瞬间获取适合的电转参数组合。整个优化过程只需要3天。经过优化后的细胞转染效率平均提高25%。

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不同的电转参数,电转后细胞的存活率和阳性率差异很大


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1号组(存活率:73.6%;荧光率90%)


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2号组(存活率:32.3%;荧光率100%)


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5号组(存活率:15%;荧光率100%)


分子运输载体:

任何的转染技术,外源DNA分子在进入细胞之前,必须实现2个关键过程,一是要使DNA尽可能接触到细胞膜,二是要诱导细胞膜发生可逆变化,使细胞膜瞬间开孔,使外源DNA分子通过细胞膜上的孔洞进入到细胞质中。基于这个技术原理,我们使用特殊分子材料粘附DNA分子,带有正电荷的DNA分子颗粒可以大量吸附到细胞膜表面。在电击作用下细胞膜瞬间开孔,DNA分子由此进入到细胞质中。并且可以有效防止DNA被细胞内的核酸酶快速降解,延长了DNA在细胞内的半衰期,并解决了DNA进入细胞核的障碍。从而大大提高了细胞的转染效率和基因编辑效率。

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电转染技术运输DNA的过程:1.DNA粘附到细胞膜上;2.电击穿孔;3. 包裹有DNA的囊泡形成;4. DNA被运输到细胞内


促进Cas9蛋白解离的Enhancer

在sgRNA的引导下,Cas9蛋白对靶序列进行切割并产生DSB(双链断裂)。然而Cas9蛋白并不会立即从靶位点DSB上解离下来,反而会非常牢固地结合在靶位点上,其解离过程非常缓慢,会持续6-15小时。由于Cas9蛋白在靶位点DSB上的稳定结合,导致DSB躲过了基因组修复系统的监控,不能对双链断裂进行及时的修复(编辑)。这是影响基因编辑效率的一个重要因素。

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a. Cas9蛋白在靶位点处产生双链断裂(DSB),并稳定结合在靶位点DSB上

b. 体外条件下,Cas9蛋白和靶位点DNA结合的动力学分析:虚线左侧是分子间结合的速度;虚线右侧是分子复合物解离的速度


为此,我们在电转体系中引入一种分子——Enhancer,可以促进非互补链的3’端序列从Cas9蛋白中游离出来,破坏Cas9-DSB结合的稳定性,并招募SSB蛋白(单链结合蛋白)等基因组修复因子,促进对双链断裂位点的修复,因而可以进一步提高基因编辑效率。


智能算法准确计算基因编辑效率

经过Cas9编辑的混合细胞中存在多种基因型,其结果分析被认为是整个工作流程当中比较繁琐的环节。NGS测序是基因组编辑分析的金标准,但是成本高、耗时长。另一种更为常规的做法是,将混合细胞的PCR产物进行亚克隆,挑选几十到上百个单克隆进行测序分析,从中可以统计到混合细胞中所出现的基因型情况及其发生频率。但这项目工作耗时极长、工作量巨大。因此,找到一种快速廉价的结果分析方法是实现MixClone™技术的最后一公里路。

由于混合细胞中存在多种基因型,将其PCR产物直接进行测序的话,切割位点下游的序列将会出现多重套峰,每个套峰间两两组合将可以产生数十亿、数百亿种排列组合,难以确定实际的编辑后序列。

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上图:混合细胞中存在多种基因型,PCR产物测序出现套峰

下图:野生型细胞,PCR产物测序单一峰型


为了解决这个问题,我们借助了一套智能化算法来准确计算出混合细胞中的实际基因型。其精确度可以媲美NGS测序,能够对Sanger测序数据进行快速的、具有可重复性的分析,且比NGS成本低100倍。该算法的主要逻辑是:

1. 将sgRNA和野生型序列进行比对,推断预期的切割位点,并根据Cas9基因编辑产生Indel的特点,围绕着预期切割位点,采用标准的非负线性建模,构建一个庞大的模拟编辑序列库。

2. 将预期切割位点上游的野生型序列和实验样品测序结果进行比对,找到二者间不匹配的地方,即找到实际的切割位点,并确定套峰分析区域(实际切割位点上下游的一部分序列)。

3. 将实验样品的套峰分析区域与模拟编辑序列库进行比对,通过非负最小二乘回归,从模拟编辑序列库中找到与实验样品测序图谱吻合的线性组合(即有可能存在于样品中的序列组合)。计算R2,评估二者的拟合度。

4. 由于测序峰图上碱基的峰型高度与该碱基的丰度呈线性相关。因此通过统计每一个位置碱基的峰型高度,可以确定突变位点处碱基在序列总体中的相对丰度。通过标准误差方差-协方差矩阵的二次t检验计算出P值,判定相对丰度评估的显著性。

5. 输出:实验样品的编辑效率;被编辑后的序列以及其在样品中的占比;以及本次分析的可信度。

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基于测序峰图的智能分析算法

1. 基因编辑效率: Indel%: 94

2. 拟合度R2: 0.95 0.95(拟合度良好)

3. 测序样品中的编辑序列及其所占的比例


|   MixClone™基因敲除细胞的应用案例

CAR-T细胞的DGK基因敲除及其抗肿瘤活性分析

实验流程

Day 1: CRISPR/Cas9转染139 CAR-T细胞,敲除DGK基因

Day 5: 深度测序分析脱靶效应

Day 9: 抗肿瘤活性分析


Day 1: CRISPR/Cas9转染139 CAR-T细胞,敲除DGK基因

使用CRISPR/Cas9技术在139 CAR-T细胞上分别对DGKα基因、DGKζ基因、DGKα和DGKζ双基因(DGKαζ)进行敲除。基因编辑效率(Indel)可以达到80%-90%;移码突变的效率分别为66.7%(αKO 139 CAR-T)和59.6%(ζKO 139 CAR-T)。基因水平的敲除效果分析与蛋白水平检测(Western blot)的结果一致。

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左:基因编辑效率;右:移码突变效率(IF: in-frame; OF: out-of-frame)


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 Western Blot分析


Day 5:深度测序分析脱靶效应

对基因敲除细胞进行深度测序分析(in silico analysis和Digenome-seq),发现无明显的脱靶效应

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Day 9: 抗肿瘤活性分析

139 CAR-T细胞的杀伤活性分析

用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与139 CAR-T细胞(AAVS1 KO、DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO)共培养,18小时后,收集细胞,计算U87vIII肿瘤细胞的死亡百分率,进行细胞杀伤活性分析。

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(AAVS1 KO 139 CAR-T细胞作为阴性对照)


实验证明DGK基因敲除的139 CAR-T细胞(DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO)比对照CAR-T细胞(AAVS1 KO)有更显著的细胞杀伤作用。


细胞因子浓度水平测定

用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与139 CAR-T细胞(AAVS1 KO、DGKα KO、DGKζ KO、DGKαζ KO)共培养,18小时后,收集共培养物的上清,对上清中的细胞因子(IL2、IFNγ)含量进行测定。

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细胞因子分泌量(IFNγ和IL2)的分析


DGKαζ KO双基因敲除的139 CAR-T细胞比DGKα KO或DGKζ KO单基因敲除的139 CAR-T细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和IL2,DGKαζ双基因敲除协同促进139 CAR-T细胞的效应功能。


139 CAR-T细胞增殖能力分析

将经CellTrace标记的139 CAR-T细胞(AAVS1 KO、DGKαζ KO)分别与U87vIII肿瘤细胞共培养4天后,收集139 CAR-T细胞,并和新的U87vIII肿瘤细胞共培养1天。通过流式细胞术分析139 CAR-T细胞的增殖情况。

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结果表明,在肿瘤细胞的重复刺激下,AAVS1 KO 139 CAR-T细胞进入衰退状态,几乎不增殖;相反,DGKαζ KO 139 CAR-T细胞则越过衰退障碍,成功增殖。


体内肿瘤杀伤活性分析

将1×106的U87vIII肿瘤细胞皮下注射到8周大的NSG小鼠体内,皮下注射后第28天和第32天,分别注射5×106 的139 CAR-T细胞(T细胞、AAVS1 KO 139 CAR-T、DGKαζ KO 139 CAR-T)。在第32天到第35天期间,每天腹腔注射替莫唑胺。每两周测定肿瘤大小。

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结果表明,在肿瘤异种移植小鼠模型中, T细胞和AAVS1 KO 139 CAR-T细胞均未能控制肿瘤消退。相比之下,在接种后第56天,DGKαζ KO 139 CAR-T细胞可以引起明显的肿瘤消退。

本案例通过CRISPR/Cas9技术敲除DGK基因来提高CAR-T细胞的抗实体瘤能力,为人类癌症免疫治疗提供一种新思路。

本案例也表明MixClone™基因敲除细胞可以用于基因功能缺失性研究、基因通路相关的细胞信号研究、基因敲除细胞的体外成瘤性研究以及细胞增殖能力等研究。具有效率高、周期短、成本低等优势,是新一代的基因功能分析工具。



|   参考文献

Smith I, Greenside PG, Natoli T, Lahr DL, Wadden D, Tirosh I, et al. (2017) Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol 15(11): e2003213.

E. Imai, Y. Isaka. Gene electrotransfer: Potential for gene therapy of renal diseases. Kidney Int., 61 (2002), pp. 37-41

C. D. Richardson, G. J. Ray, M. A. DeWitt, G. L. Curie, J. E. Corn, Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339–344 (2016).

Jung IY, Kim YY, Yu HS, Lee M, Kim S, Lee J. CRISPR/Cas9-mediated knockout of DGK improves antitumor activities of human T cells. Cancer Res. 2018;78(16):4692–703.


友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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