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HepG2肝癌细胞编辑

HepG2细胞在药物作用下的相关研究中代谢酶始终保持稳定,所含有的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞同源,是体外肝细胞代谢或遗传毒性试验方面的理想的细胞系。如何在HepG2细胞株上进行基因敲除/基因敲入/基因突变也是各个课题组特别关心的问题!海星生物经过优化,可以为客户提供编辑效率高、结果稳定、周期快速的细胞基因敲除的解决方案。

 

|   具体的HepG2细胞基因敲除/基因敲入/基因突变的技术流程如下

单克隆流程.jpg


整个技术流程中,构建HepG2细胞基因编辑株的难点主要在于:

HepG2细胞克隆形成率低;

HepG2细胞克隆形成慢,周期被大大延长;

HepG2细胞转染效率低,转染后存活率低;

针对以上HepG2基因编辑几个难点,海星生物进行了研发,逐一提出解决方案,为快速获得基因编辑成功的纯合克隆。具体优化包括以下方面:

 

1. HepG2细胞的培养条件的优化及克隆形成的优化;

HepG2属于比较好培养的细胞类型。参考ATCC推荐的培养条件,我们选择的培养条件为EMSS+10% fetal bovine serum(专门优化筛选批次)。EMSS基础培养基,海星生物自主研发配制,对渗透压进行了专门的优化,大大提高了HepG2细胞增殖的速度,也使得HepG2的细胞的形态更好。

经过细胞株的优选, HepG2细胞增殖速度和克隆形成率都远远优于普通细胞。

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如培养的HepG2形态不太理想,可考虑添加1%NEAA,对于细胞状态会有所改善。正常情况下,HD加10%FBS的培养条件足矣。

 

2. HepG2细胞优化的电转效率和存活率:

采用Cas9X™ | 海星生物VIRUS-Free™技术对细胞进行转染,与病毒法相比,效率更高,周期更短,而且可以规避病毒重新复制的风险。

为提高转染效率,海星生物优化了电转缓冲系统。加入了吸附剂,促进DNA吸附到细胞的表面;加大的缓冲液的电阻,从而可以提供电转的电压,从而大幅度的提升了电转的效率,是传统缓冲系统的3-5倍的效率,达到80%。经过优化,细胞的存活率提升到90%,细胞的基因编辑的效率也得到了大幅提升。

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                            【GFP表达载体电转后72小时对比图片】

 

3. HepG2细胞的快速克隆化条件优化;

HepG2细胞喜好抱团生长,克隆形成困难。按照常规方法,测定细胞的克隆形成率不足3%,形成克隆体积非常小。同时,由于克隆团并不呈规则的形状,难以判断是单个细胞扩增所得还是多个细胞抱团生长形成的克隆团。

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       hepG2-克隆形成14d-200x              HCT116-克隆形成14d-40x

 

HepG2细胞如此低的克隆形成能力,给获得单克隆带来了巨大困难。极限稀释的方法下,要么选择一次性设立不同梯度的细胞密度,接种大量孔板,或者反复实验摸索合适的接种个数,总而言之,工作量相当巨大。尽管如此,经过漫长的3-4周的等待,仍然未必能获得足够多的用于鉴定的单个克隆。

HepG2细胞的单克隆化效率低,再加上基因定点突变效率远低于基因敲除效率,两种因素叠加导致拿到突变纯合子的概率极低。Cas9X™ | 海星生物的ClonePlus™技术, 采用专有的胶体表面处理,HepG2细胞株的克隆率超过95%,可以轻松进行克隆分离和克隆PCR鉴定,大幅提升HepG2细胞的鉴定阳性率。海星生物使用ClonePlusTM技术,HepG2的细胞克隆形成能够达到95%以上,而且克隆形成的时间可缩短到1-2周的时间,大大压缩了整个单克隆生长的时间周期,赢得宝贵的时间。

 

ClonePlus™技术:是Cas9X™技术平台研发的专有高效细胞敲除技术,主要通过高通量电转系统和高通量的克隆分选技术结合,获得基因编辑的单细胞,其克隆形成率可以达98%,就算是克隆形成率低的细胞株也能获得敲除单克隆,针对悬浮细胞也有更高的单克隆形成率。

VIRUS-Free™技术:是一种利用转座子进行细胞稳转株的构建和筛选的技术,以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域,能将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构,并在基因组里面的固定序列位置进行插入,从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用,并充分体现出其:低成本、高效率、基因表达稳定的特点。

 

4. HepG2细胞株快速特性;
市面上多数HepG2细胞质量均比较差,转染效率很低。筛选到优质的HepG2细胞是项目成功的关键因素之一。(海星生物自有的HepG2细胞已成功完成23个基因编辑项目,其中包含基因敲除和定点突变项目→点击查看)。

 


友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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