|   qRT-PCR主要是基于病毒基因序列的检测方法

该方法的试剂容易实现，检测灵敏度高（据报道其灵敏度为200 copies/mL），是武汉新冠肺炎临床确诊的主要依据。

 
|   基因敲除细胞株（系）

1.  但是其检测条件要求比较高，需要专业的仪器(例如PCR仪)和专门的分子检测实验室，实验条件不达标时，会导致气溶胶的污染，造成假阳性。另外
 
PCR仪器有检测样本，检测空间，检测通量等限制，没办法进行大规模的检测，这些问题导致确诊的有效率比较低。
 
PCR实验室面积必须≥75% ，且具备四个区域，包括试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区、产物分析区。
 
PCR实验室操作人员，须经过PCR技术操作培训，并取得合格证
 
还有核酸提取-结果获取分析等场地设备要求。整体流程相对复杂，需要由专业人士操作
 
重大疫区的诊断困境
 
由于其诸多因素（场地-技术-人员-设备）的限制，重大疫区面临着巨大的临床分子诊断压力
 
确诊和疑似病例数仍在上升，全国还有近十万人正在接受医学观察，临床诊治的压力巨大
 
实验室条件要求高，人员专业性要求高，有检测资质的机构较少
 
目前等待核酸检测人数大大超过检测能力，采样后需要1天或者更长时间得到结果
 
需要快速建成高通量的检测中心。
 
|   其它诊断方案：
 
针对上述困境，我们尝试从生物技术角度考虑还有哪些方案可以用于提高分子诊断的效率。

等温扩增法和PCR功能一样，都是指数式扩增DNA分子
 
与PCR不同的是，等温扩增技术不需要经过温度变化的周期
 
DNA模板双链变单链、引物结合、与延伸合成全都在重组酶、单链结合蛋白等辅助下进行
 
DNA扩增在一个温度（常温）下即可完成
 
等温扩增法的一个巨大优势就是不需要特殊的设备，如PCR仪
 
等温扩增技术也被单独应用到分子诊断领域，但其灵敏度不如qRT-PCR或者数字PCR高，使用有局限
 
使用有局限。

2.胶体金免疫层析法
胶体金是通过检测病毒本身的抗原或者病毒感染后体内产生的抗体来实现快速POCT筛查
 
具有检测时间短，操作简单，肉眼可判断结果等优点。
 
特别适合现场快速筛查，不需要专业的仪器，也不需要特殊的环境。（和验孕棒使用方法类似）
 
可方便快速地用于社区卫生服务中心、基层医院的早筛早诊，增加检测和诊疗的时效性。
 
但在病毒浓度低的时候，会导致漏检。总体来说，胶体金法的敏感度和特异性会较核酸检测更弱，假阳性率、假阴性率出现的概率会更高。

3. 其它
 
缩短样品前处理时间，提升检测通量，提升检测自动化也是一个重要研究方向。
 
如开发能降低检测对环境要求的仪器或试剂。这次所有的检测都必须在P2(二级生物安全实验室)进行。这是一大限制因素，开发不依赖于P2实验室的检测试剂和方法，也是当前的一个重要方向。

|   理想的诊断试剂盒2019-nCoV

从市面上已有的这些诊断试剂盒看，目前还没有一款比较理想的试剂盒。理想的诊断试剂盒可以从以下两个维度进行考量：

 
1. 产品性能
 
敏感度高
 
特异性高
 
结果分析简单
 
检测时间短
 
抗干扰性强

2.即时检测可操作性
 
不需要复杂的仪器设备和冷链运输
 
可携带性
 
操作简易

|   CRISPR分子诊断技术

目前市面上还没有出现可以满足上述条件的试剂盒，但在寨卡病毒、HPV等病毒诊断上表现优异的CRISPR分子诊断技术或许作为我们后续试剂盒开发的关注点。CRISPR分子诊断技术几乎整合了上述各种检测方案的优势，在IVD产业中具有巨大潜力。既有qPCR、数字PCR等其它分子诊断技术的卓越性能，又不依赖于复杂的仪器，而且具有免疫层析方法的方便性和低成本。下面我们以张峰团队研发的SHERLOCK技术为例进行展开介绍。

1. C2c2/Cas13a系统的特点
2015年，张峰团队从基因库里发现了三个新的CRISPR-Cas系统：C2c1、C2c2和C2c3。其中C2c2被命名为Cas13a。C2c2/Cas13a在功能和机理上有以下特点：
 
不需要tracrRNA，只需要crRNA的指导
 
C2c2-crRNA的靶分子不是DNA，而是入侵病原的单链RNA
 
C2c2-crRNA一旦找到并结合匹配的RNA后，进入激活状态，除了剪切靶RNA外，碰到任何单链RNA都可非特异性地将其剪切、降解。