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想要细胞基因敲除?技术和策略全攻略

基因功能研究,尤其是在细胞系的基因功能研究,通常是从三板斧开始的,基因干扰基因过表达基因敲除,今天我们来讲讲,最耀眼的基因敲除!

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想必大家都听过,基因敲除基因干扰因为很相似,往往被不明就里地混用,但实际上基因干扰只是在转录后水平上的降低基因表达,并不能像基因敲除那样完全地把基因从基因组中剔除,有时候也会因为背景不干净,导致产生的表型难以分析,如果是干扰实验,蛋白表达降不下去,表型差异出不来,就只能做敲除咯

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江湖上一直流传着4+2的传说,4是四种技术手段(蛋白法、常规瞬转质粒法、病毒法、Virus-Free稳转质粒法),2是两种gRNA设计策略(移码敲除、片段敲除),亲自动手的科研"汪",或者服务公司从4+2中混搭形成了自己的风格,十八般武艺,分外热闹。

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新人小白们,面对着4+2的江湖,内心是崩溃的。师兄说蛋白法好 见效快 干净无残留;师姐告诉你 病毒法好 省事又高效;导师也有建议 说别搞那些幺蛾子 瞬转质粒价格便宜 还能药筛;实验方法让人挠头,敲除策略也不省心,A公司做移码敲除 说高效快捷成功率高,B公司做片段敲除 说稳定省心WB干净……

我们就来盘点一下这个4+2的江湖,评一评这十八般武艺


4种基因敲除的技术手段

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总的来说,蛋白法不需要构建载体,最快捷,但是sgRNA容易降解,操作难度大,一般更多应用于点突变和定点插入;常规瞬转质粒法构建简单,但是效率低;病毒法效率高,但是周期长,成本更高;Virus-Free稳转质粒法稳定整合而不需要包病毒,效率高周期短,是一种很好的替代病毒的方法。


两种gRNA设计策略

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这是基因敲除通用的两种方法,都能实现基因功能的沉默。

移码敲除效率高,设计简单,但是后续蛋白检测风险较大,往往会出现WB敲除不干净的现象,导致敲除变干扰;片段敲除需要双gRNA同时起作用,效率较低,但是后续蛋白检测背景干净,结果有保证,更好发文章。


结语:

4+2如何选择,取决于最终目的和周期成本预算,也取决于不同细胞不同基因的类型。有位不知名的技术专家X man说过,“像293这种细胞,我闭着眼随便做,都能拿到一堆纯合子”。最后,小海星写得这么用心,必须要打个小广告咯,对于大部分细胞系的基因敲除来说,我们的Virus-Free转座子技术结合片段敲除策略,应该是这个江湖中性价比最高的一把斧头了。


友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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