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如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年

CRISPR是一个不断突破现有认知的技术工具,不仅可以实现基因敲除/突变/敲入,现在它还可以做基因过表达/基因沉默/基因调控等,接下来就听Cas9X™为您仔细介绍一下这位“斜杆青年”。

在生物学研究中,CRISPR-gRNA文库是一种高通量筛选靶基因的工具,可大规模或全基因组进行功能筛选,涉及信号通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等方面,高分的研究成果层出不穷。海星生物在gRNA文库筛选方面积累了丰富的经验,能够帮助客户快速应用最新的技术构建CRISPR KO(基因敲除)、CRISPRa(基因激活)文库、CRISPRi(基因抑制/沉默),并提供全套的细胞功能筛选服务,涵括文库构建、病毒文库、细胞转染和筛选、NGS测序与数据分析服务。下面就和我们一起仔细了解这些新的应用技术吧!

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年

CRISPR-gRNA文库构建技术流程

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年


01、CRISPRa(基因激活)

CRISPRa(基因激活)系统是用于激活内源性基因转录的强大工具,切割失活的Cas9(dCas9)连上转录激活子(如VP64、p65和HSF1),可以有效促进基因组特定位点的转录。研究显示,CRISPRa技术可以使得基因的转录得到了两倍到数千倍的增长,许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。

服务的内容:客户提供相关的需要激活表达的基因信息,海星生物将按照基因的生物信息特点,设计gRNA、构建载体、包装病毒通过病毒转染到目的细胞,筛选出激高表达或者合适的gRNA序列,并构建成CRISPRa稳转细胞株,并使用Q-PCR对目的基因表达量进行检测,并依据客户的需求提供单克隆建立和表型的筛选服务。

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服务优势:通过内源基因组背景进行激活,激活表达量可以从2倍到几个数量级的提升。

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年


CRISPRa vs ORF过表达

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年


02、CRISPRi(基因抑制/沉默)

RISPRi (基因抑制/沉默)系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具,当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制的效率。此外,dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2,抑制效果更佳。

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年


由于dCas9-KRAB CRISPRi系统是在DNA水平抑制基因表达,因此适用于多种类型的基因,包括:mRNA、非编码RNA、microRNA、反义转录本、核定位RNA以及聚合酶III 转录本等基因的转录抑制。

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年

CRISPRi显著的转录抑制效果

服务内容:

客户只需要提供要进行敲减的基因和转录本信息,将有海星生物设计gRNA序列,构建病毒载体,病毒包装后转染目的细胞,并根据客户的需求进行筛选出符合敲减水平低gRNA,并提供CRISPRi稳转细胞株的构建和单克隆的扩增筛选的服务。

技术优势:

不改变内源基因组背景、基因抑制效果可筛选、适用更多基因种类。

RNAi vs CRISPRi

研究基因功能最常见的方法是,减少或者阻断基因表达,然后进行表型分析。RNAi和CRISPRi都是常用的基因表达水平敲低的研究工具。


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RNA干扰(RNAi)靶向细胞质中成熟的RNA,而CRISPRi则在细胞核内阻止转录的起始,因而敲低效果更为显著。此外RNAi的脱靶效应要远远高于CRISPRi。

如何用Cas9做基因过表达/沉默?解码CRISPR-斜杆青年

CRISPRi的敲低效果显著优于RNA


友情链接: 国家实验细胞资源共享平台 ATCC Zhang Lab
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